Nació el 27 de diciembre de 1822 en Dôle (región de Jura, Francia). Su padre había sido soldado de Napoleón, pero después de dejar el ejército puso una curtiduría, donde transcurrió la infancia del pequeño Louis. De joven, no fue un estudiante prometedor; de hecho, si mostraba alguna aptitud especial era la pintura. Su primera ambición fue la de ser profesor de arte. En 1842, tras ser maestro en la Escuela Real de Besançon, obtuvo su título de bachillerato, con calificación "mediocre" en química. Tras licenciarse y asistir a las lecciones del gran químico francés Jean-Baptiste Dumas, comenzó a interesarse por la química. A pesar de esos principios desfavorables en la química, Pasteur se empeñó en que la química se convirtiera en el trabajo de su vida. En pocos años, el estudiante "mediocre" dirigió un programa de investigación que le dio fama internacional.